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干細胞在急性腎損傷中的治療作用及進展
發布時間 : 2019-01-16

急性腎損傷( acute kidney injury,AKI) 是臨床常見的危重癥之一,具有高發生率和高病死率的特征。2002 年,急性透析質量指導組( acute dialysis quality initiative group,ADQI) 制定了 AKI RIFLE 分級診斷標準,將 AKI 分為 3 個嚴重程度級別:危險( risk) 、損傷( injury) 、衰竭( failure) 2 個預后級別: 腎衰竭喪失 ( loss) 、終末期腎病 ( end stage renal disease,ESRD) 。 2005 年,急性腎損傷網絡( acute kidney injury network,AKIN) 會議在基于 RIFLE 標準上進行修訂,將 AKI( 診斷標準) 定義為: 由導致腎臟結構或功能變化的損傷引起的腎衰竭突然( 48 h 以內)下降,表現為血肌酐絕對值增加≥0. 3 mg/dl( ≥26.4 μmol /L) ,或者增加≥50% ( 達到基線值的 1.5 倍) ,或者尿量 < 0.5 ml/kg/h 持續超過 6 h。并將 AKI 分為 1、2、3 期 分別對應 RIFLE 標準的危險、損傷和衰竭。AKI 常見病因是腎缺血和腎中毒引起的急性腎小管壞死( acute tubular necrosis,ATN) ,ATN與修復的病理生理學機制主要包括: ( 1) 早期: 各種因素( 如:缺血、中毒、膿毒血癥) 引起的腎小管上皮細胞變性、去極化、刷狀緣破壞; ( 2) 壞死期: 上皮細胞壞死脫落阻塞管腔、腎小管基底膜暴露; ( 3) 修復期: 健存細胞遷移、新生上皮細胞增殖、黏附于基底膜,腎小管上皮細胞極性形成、結構重建、功能恢復 。多年來,盡管血液凈化技術和危重癥醫學得到了突飛猛進的發展,但敗血癥、休克和嚴重創傷所致 AKI 死亡率仍高達 50% 以上。如何提高腎小管上皮細胞壞死后的修復再生、降低 AKI 死亡率,一直是醫學界研究的一項重大課題。隨著干細胞醫學、組織工程學、再生醫學等學科的迅猛發展,也給 AKI 的修復再生提供了一條新的道路。

1、干細胞的概念

干細胞( stem cells,SCs) 是一類具有自我更新能力的多潛能細胞,在一定條件下可分化為多種功能細胞。根據干細胞的發育潛能可分為全能干細胞、多能干細胞和專能干細胞三類。全能干細胞是一種高度未分化細胞,具有無限增殖、自我更新、多向分化等特征。胚胎干細胞( embryonic stem cells,ESCs) 是這類細胞的代表。多能干細胞具有分化出多種細胞組織的潛能,可以分化成體內各種細胞,進而形成身體的各種組織和器官,因此其在器官再生、修復和疾病治療方面極具應用價值。其典型代表是骨髓造血干細胞( hemopoietic stem cells,HSCs) 。專能干細胞是多能干細胞進一步分化的結果,專能干細胞只能分化成某一類型的細胞。

2、胚胎干細胞

ESCs 是來源于囊胚的內細胞團,具有多潛能性。然而,移植不定項分化 ESCs 會誘導畸胎瘤發生。因此,在移植之前必須先在一定程度上對 ESCs 進行分化。通過應用維甲酸、活化素-A (    activin-A) 、骨形成蛋白-4 ( bone morphogenetic protein-4,BMP-4) 、BMP-7 可以讓培養的HSCs 誘導表達腎小管上皮細胞標志 KSP、足細胞標志 WT-1 和 Nephrin、中胚層標志Brachyury、后腎間充質標志 Six2 ,WT-1 和Pax2等。此外,注入顯影劑觀察可發現,ESCs幾乎100% 被納入腎小管上皮細[2]胞 。因此,ESCs 被認為是腎臟修復損傷的最佳細胞來源之一。然而,人類 ESCs 設計相關的倫理和法律問題,使得研究工作不能進一步開展。

3、誘導多潛能干細胞

    為了替代 ESCs,學者們研究開發了多能干細胞 ( iPS 細胞) [3]。最近,人類 iPS 細胞已經成功從皮膚成纖維細胞中誘導生成。通過逆轉錄病毒轉移的 4 個基因( Oct3 /4,Sox2,Klf4和c-myc) 在培養的體細胞中可以轉化為類似 ESCs 的多潛能細胞。這 4 個基因被認為是具有全能性的轉錄因子。由于iPS 細胞類似 ESCs 具有多潛能性,并可以從人類體細胞中誘導生成,這意味著不存在倫理和道德問題,因此是iPS 細胞在AKI損傷修復方面具有相當前景。然而,即使 AKI 修復的資源隨處可得,iPS 細胞分化誘導的機制仍存在很多空白。并且發現iPS細胞存在和ESCs同樣的問題,移植未分化的iPS細胞極易形[3]成畸胎瘤。雖然如此,但已經有多篇文獻成功報道了多種類 型的體細胞被重編程為 iPS 細胞,包括心血管細胞[5]、造血功能細胞[6]、肝細胞、胃上皮細胞[7]、間充質干細胞( mesenchymal stromal cells, MSCs) 和成熟胰島β 細胞。此外,研究發現iPS細胞可以不包括原癌基因c-myc[4],這將大大降低畸胎瘤形成的概率。相信今后iPS細胞在AKI損傷修復的舞臺上將占據一席之地。

4、骨髓源性干細胞

骨髓包含了各種類型的干細胞,例如: HSCs、MSCs、內皮祖細胞( endothelium progenitor cells, EPCs) 等,它們在AKI的損傷修復中都起到了一定的作用。

4.1 造血干細胞 許多驗證性實驗表明HSCs對腎小管和腎小球系膜間隙的修復再生具有杰出貢獻[8 ~11]。AKI發生后,增加血液中的HSCs 能夠進一步作用于其病理生理過程。研究人員在AKI修復再生過程中應用粒細胞集落刺激因子( G-CSF)、或直接輸注HSCs,使血液中HSCs增加,觀察其療效并進行研究分析,發現不同研究給出了不同的結果,究其原因可能是由于AKI動物模型的不同、抑或HSCs類型和劑量的不同,抑或試驗標準不同。結果究竟如何有待進一步的meta分析結果。 G-CSF治療能在葉酸導致的AKI損傷后3d 和7d明顯改善受損腎組織的結構和功能。這種改善與在腎臟修復再生過程中摻入10%骨髓源性干細胞密切相關[11]。在順鉑誘導的AKI小鼠模型中,動員HSCs,使用G-CSF或巨噬細胞集落刺激因子( M-CSF) ,可以明顯改善腎損傷以及動物的生存率[12]。相比之下,動員 HSCs 被證明不利于缺血性ATN小鼠模型[13]。動員HSCs的小鼠其血清肌酐增加水平以及腎小管損傷程度明顯高于粒細胞減少小鼠。這可能是由于動員了G-CSF以外的HSCs,如粒細胞,其會進一步加劇 AKI。研究人員正在制定草案關于動員無誘導粒細胞增多的HSCs,作為AKI 治療的又一個潛在研究方向[13]。

4.2 間充質干細胞大量實驗研究顯示,當AKI情況下給予外源性MSCs可以改善腎小球、腎小管、腎間質的結構和功能的恢復。Togel 等[14]實驗顯示無論是同源性 MSCs 抑或是異源性 MSCs 對于AKI的治療都是安全有效的,減少了晚期的纖維化以及腎衰竭的丟失。Morigi 等[15]發現人臍帶血間充質干細胞( human cord blood-mesenchymal stem cells, CB-MSCs) 對實驗性AKI 具有治療作用。給由順鉑引起 AKI 的免疫缺陷小鼠注入 CB-MSCs可以改善腎衰竭以及腎小管細胞的損傷情況,增加其存活率。移植的CB-MSCs定位于局部有毛細血管 改建和中性粒細胞浸潤的腎小管周圍區域。CB-MSCs 通過產生生長因子從而減少細胞凋亡并且增加腎小管細胞的增殖。CB-MSCs 對腎臟的保護作用進一步通過其抑制氧化損傷、誘導腎小管上皮細胞中的促生存因子Akt得到了證實。在 CB-MSCs 與受損腎小管上皮細胞共同培養的實驗中證實CB-MSCs 在體外具有促進生長因子增加和抑制IL-1β 和TNF-α 生成的能力,并且具有治療再生和抗炎作用。 最近研究顯示 MSCs 的修復機制并不是直接再生受損腎單位而是通過旁分泌和內分泌作用于受損的腎單位。Tsuda 等[16]研究發現同種異體的胎膜間質干細胞( allogenic fetal membrane-derived MSCs,FM-MSCs) 具有腎臟修復作用。將患有腎炎的大鼠分為兩組分別注入同種異體的胎膜間質干細胞(FM-MSCs 組)和磷酸鹽緩沖液(PBS組) 。PBS 組的腎炎大鼠表現出尿蛋白大量外排,而 FM-MSCs 組尿蛋白外排不明顯( P <0.05) 。此外還發現FM-MSCs 具有減少活化的腎小球系膜細胞增殖、腎小球單核巨噬細胞濾過、腎小球系膜基質積聚、腎小球炎性介質(TNF-α,MCP-1,TGF-β)和細胞外基質表達的功能。實驗數據顯示FM-MSCs是通過旁分泌來實現損傷修復的。同樣,Rampino等[17]也證明了MSCs很少存在于腎單位中,而是通過調節炎性因子和趨化因子( IL-6,TGF-β,PDGF-β,HGF) ,減低血肌酐升高、腎小球病理組織的損傷,從 而修復抗 Thy1 腎炎引起的急性腎損傷。

4.3 內皮祖細胞 EPCs是成熟血管內皮細胞的前體細胞,亦稱成血管細胞(angioblast) 。Chade 等[18]研究顯示將同源 性 EPCs 進行腎內灌注對腎微血管的結構和功能具有保護作 用,并且能夠減少微血管的重塑。此外, EPCs 能形成新血管并 加速其成熟和穩定。在生理或病理因素的刺激下, EPCs 可以 從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復。Patschan等[19]證 實了小鼠單側腎動脈鉗夾后3~6h 的腎缺血性AKI能夠誘導EPCs快速動員,歸巢到脾臟,使其成為已動員EPCs的臨時儲存庫。而后期的AKI缺血再灌注損傷修復又與脾臟儲存庫EPCs的動員和腎乳頭區域EPCs的堆積有關。進行髓質乳頭來源濃縮EPCs 的移植對于缺血損傷的腎組織細胞具有部分保護作用,提示EPCs具有維持和修復腎臟內皮細胞的潛在作用。 因此,EPCs將成為促進AKI修復的又一有效手段。

5、腎源性干細胞

在過去的幾年里,成人腎干/祖細胞( ARPCs) 已經確定在人類腎臟[20],特別是在腎小囊和近端小管的再生修復中發揮著重要作用,可能成為治療AKI的理想細胞。 Kim等[21]為了闡明ARPCs的定位和性質,通過免疫組織化學的方法對31個正常嬰兒、成人腎臟中干細胞標志物CD133的表達以及CD133和Ki-67、腎小管特異標志物的共同表達進行檢測分析,發現 CD133和Ki-67同時表達于嬰兒腎臟內,而在成體腎臟中無Ki-67 表達。CD+133 大量儲存于近端小管的S3段,并且與遠端小管的標志物共同表達,提示ARPCs具有多能性。在正常的成人腎臟內存在著大量的CD+133,其能夠作為AKI的病理特征指標。在免疫缺乏性腎小球腎炎的發病過程中, CD133和Ki-67的升高預示著腎衰竭正在恢復中。這些結果顯示ARPCs 主要存在于近曲小管的S3段,正常狀況下處于有絲分裂靜止期,當細胞損傷時可被誘導激活,對受損細胞進行修復再生。Lee 等[22]為了揭示 ARPCs 在腎缺血再灌注性AKI小鼠模型中的修復再生作用行相關實驗,實驗顯示ARPCs 呈紡錘狀,具有不斷自我更新能力,并且能表達 Oct-4,Pax-2,Wnt-4,WT-1,波形蛋白,α-平滑肌肌動蛋白,CD29 和S100A4 等一系列細胞因子。通過腎內注射ARPCs 對缺血再灌注性AKI 小鼠具有治療作用,如降低血清尿素氮,對梗死區局限化,減少壞死損傷。傷后7d內,一些ARPCs 形成了含有紅細胞的血管,另一些融入了腎小管。此外, ARPCs 治療明顯降低了缺血性損傷后小鼠的死亡率。

6、羊水干細胞

人類羊水干細胞( human amniotic fluid stem cells, hAFSCs) 具有易大量獲得、低畸胎瘤發生率、高分化潛能等特性。作為干細胞治療的新方向,其并不牽扯到胚胎干細胞相關的倫理問題。 Siegel 等[23]將小鼠胚胎的腎臟分離成單細胞懸液與單克隆hAFSCs 混合重新塑形成功形成了腎臟結構,證明hAFSCs 可以通過調節某些免疫機制或分子機制的表達來完成腎組織的修復。作為兩個激酶復合物mTORC1 和mTORC2 的一部分,哺乳動物雷帕霉素靶( mTOR) 是一個重要的信號通路,它對許多以腎臟癥狀為特征的人類遺傳疾病的發展以及hAFSCs的分化 具有調節作用。通過特殊的siRNA途徑調節內源性的mTOR 活動顯示hAFSCs主要是作用于mTOR通路調節mTORC1和mTORC2從而對腎組織進行損傷修復。這些結果顯示hAFSCs對腎組織損傷修復具有調節作用;小鼠胚胎腎單細胞懸液和單克隆hAFSCs 的混合物將成為研究腎臟結構再生的強有力工具; mTOR途徑為腎臟疾病的研究發展提供了新的視角。Perin 等[24]首次研究成功將 hAFSCs 運用于甘油引起橫紋肌溶解癥和 ATN 的小鼠模型上。將 hAFSCs 注射入受損腎臟,應用熒光素酶標記進行發光追蹤。結果顯示 hAFSCs 對ATN 具有保護作用,緩解該階段 ATN 的急性損傷如降低血液肌酐、尿素氮濃度、腎小管損傷和細胞凋亡的數量,促進腎小管上皮細胞增殖。實驗還發現 hAFSCs 對ATN 過程具有顯著的免疫調節作用。因此,我們可以推測,hAFSCs 代表了干細胞來源的新功能,可通過調節腎的免疫環境來改善ATN引起的腎衰竭。

7、目前存在的問題與展望

    對于 AKI,干細胞治療必定是今后的一大趨勢,具有很好的發展前景。但仍然存在著很多問題有待解決,譬如:(1) 是否不同原因引起的AKI需要使用不同的干細胞進行治療? (2) 采用哪種注入方式? 局部注射抑或是血管注射? (3) 是否需要其他的輔助細胞來提高干細胞的修復再生作用? (4) 究竟是何種來源的干細胞對AKI修復再生效果更好? 單用一種干細胞抑或是多種聯用? 目前認為雖然有很多來源的干細胞參與了AKI的損傷修復,但起主要作用的可能仍是 MSCs,MSCs 對于AKI的修復作用主要是基于旁分泌或自分泌的細胞因子起作用。這個觀點正在為越來越多的學者所接受,但是其治療AKI的作用機制尚不清楚,有待進一步研究。此外,雖然干細胞研究在動物試驗中顯示出了一定效果,但在臨床上對于治療AKI是否真的有效仍然有待實踐。Behr 等[25]已發現當將MSCs作用于同源大型動物模型時, MSCs 并沒有發揮其在小鼠研究中所發揮的對AKI修復和旁分泌作用。另外,目前的研究大多局限于對AKI的研究, 對于慢性腎臟疾病的干細胞治療也將是今后的一大熱點。

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